Y187 Chemically Competent Cell  酵母感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3,112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATAlacZ, MEL1

簡(jiǎn)要說(shuō)明：

Y187菌株是GAL4系統(tǒng)酵母單雜，雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATα型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蚺cMATa型酵母菌株 (Y2HGold，AH109等)通過(guò)mating操作進(jìn)行篩庫(kù)試驗(yàn)。Transformation marker為: trp1，leu2，報(bào)告基因?yàn)椋簂acZ，MEL1。Y187有兩個(gè)報(bào)告基因：lacZ，MEL1，分別由兩種不同的啟動(dòng)子 (G1，M1)啟動(dòng)，這兩種啟動(dòng)子只有GAL4識(shí)別的17bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。Y187感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明：

1. 取pBait-AbAi質(zhì)粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收；

2. 取一支無(wú)菌的1.5ml EP管，依次加入預(yù)冷的預(yù)冷的線性pBait-AbAi質(zhì)粒1-5 µg（體積不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復(fù)一次)10µl，100µl冰上融化的Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞，PEG/LiAc 500µl，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

3. 30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

4. 每支加入20µl的二甲基亞砜（用以提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）；

5. 42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

6. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃復(fù)蘇1h（用以提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）；

7. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，用100µl 0.9% NaCl重懸，涂板，30℃培養(yǎng)48-96h。

注意事項(xiàng)：

1.PEG在低溫下易析出，請(qǐng)?jiān)诔叵聎an全溶解后使用。

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3.同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4.Y1HGold酵母菌株對(duì)高溫敏感，最適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5.菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見(jiàn)現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1mm克?。煌縎D單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見(jiàn)直徑1mm克隆。