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酵母感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化失敗的原因一般有哪些

更新時間:2025-09-26      點擊次數(shù):335
酵母感受態(tài)細胞是通過特殊處理(如化學(xué)或物理方法)使酵母細胞暫時具備吸收外源DNA能力的細胞,主要用于基因克隆、蛋白表達及酵母雙雜交等分子生物學(xué)實驗‌。
轉(zhuǎn)化成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):
‌菌落形態(tài)與數(shù)量‌:
成功轉(zhuǎn)化的酵母感受態(tài)細胞在選擇性培養(yǎng)基上應(yīng)形成‌乳白色、圓形、直徑≥1mm的單菌落‌‌。
若菌落過小(<0.5mm)或呈彌散狀(一層菌膜),則可能為轉(zhuǎn)化失敗‌。
‌轉(zhuǎn)化效率驗證‌:
單質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率通常需達到‌10³~10?cfu/μgDNA‌‌。
文庫轉(zhuǎn)化時,需在缺陷平板上獲得‌≥10?個轉(zhuǎn)化子‌(如10μL重懸液涂布后菌落數(shù)≥10個。
轉(zhuǎn)化失敗的常見原因及排查:
‌質(zhì)粒問題‌:
電泳檢測質(zhì)粒是否完整(條帶明亮、大小正確)‌。
檢查質(zhì)粒是否攜帶正確的篩選標(biāo)記‌。
‌培養(yǎng)基與操作問題‌:
確認(rèn)選擇性培養(yǎng)基配制正確(如抗生素濃度、營養(yǎng)缺陷型補充)‌。
熱激條件需嚴(yán)格(30℃孵育30min+42℃熱激20min)‌。
‌細胞狀態(tài)異常‌:
鏡檢酵母細胞是否形態(tài)正常(卵圓形、無裂解)‌。
活細胞比例需高(可通過亞甲基藍染色法驗證,活細胞無色)‌。
 

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